Из-за энергетического дефицита клетки сетчатки, особенно ганглиозные клетки зрительного нерва, подвергаются значительному окислительному стрессу и нарушениям кальциевого обмена, что в итоге приводит к их гибели.
Поскольку митохондриальная ДНК сложно редактировать, одним из наиболее многообещающих методов является аллотопическая экспрессия. Этот подход включает перенос работающей копии поврежденного митохондриального гена в ядро клетки и последующую доставку синтезированного белка обратно в митохондрии.
В новом исследовании, проведенном учеными Научного центра трансляционной медицины университета «Сириус», были протестированы пять различных митохондриальных сигнальных последовательностей (MTS), отвечающих за транспорт терапевтического белка ND4. Наиболее эффективной оказалась последовательность MTS-cox8k, использование которой в клеточной модели значительно восстанавливало митохондриальную функцию: уровень активных форм кислорода снизился на 72%, содержание кальция в митохондриях уменьшилось на 47%, а митохондриальный мембранный потенциал увеличился на 38%. Эти результаты указывают на выраженное снижение клеточного стресса и частичное восстановление энергетического обмена.
Исследование подтвердило, что выбор транспортной последовательности критически важен для успеха терапии. Универсального решения для доставки митохондриальных белков не существует: эффективность зависит от структуры конкретного белка, что требует отдельной оптимизации для каждого заболевания.
Информация в статье носит справочный характер и не заменяет консультацию врача. Перед применением рекомендаций обратитесь к специалисту.
В ходе работы была создана специализированная клеточная модель на основе линии HEK-293 с митохондриями пациентов, имеющих мутацию mt.11778G>A. Хотя эта система не полностью воспроизводит патологию ганглиозных клеток сетчатки, она представляет собой важную платформу для первичного тестирования терапевтических конструкций и контроля качества будущих препаратов.
Следующим этапом исследований станут испытания на нейрональных моделях, включая ганглиозные клетки сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов, а также доклинические исследования на животных моделях для оценки безопасности и эффективности вирусной доставки.
Хотя технология все еще находится на доклинической стадии, работа рассматривается как важный шаг к созданию нового поколения генной терапии наследственной нейропатии Лебера. Эта стратегия направлена на оптимизацию уже существующего терапевтического подхода, что может ускорить переход к практическому применению.
Разработка эффективной терапии важна, так как существующие методы лечения, включая идебенон, лишь частично замедляют прогрессирование болезни, но редко позволяют восстановить утраченное зрение. Новая стратегия приближает создание патогенетического лечения, которое может существенно изменить перспективы для пациентов с наследственной митохондриальной слепотой. Исследование осуществляется в рамках масштабного проекта «Разработка генотерапевтических продуктов для лечения наследственных ретинопатий и нейропатий» под руководством Александра Карабельского.
Евгений Лапшин, младший научный сотрудник направления «Генная терапия» Научного центра трансляционной медицины, ответил на вопросы «Ъ-Наука».
— Что такое наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) и почему эта форма наследственной слепоты считается одной из самых трудноизлечимых? Какова причина мутации и как она приводит к гибели клеток сетчатки?
— Наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) — это заболевание, приводящее к потере центрального зрения из-за дегенерации ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, формирующих зрительный нерв. LHON считается одной из самых трудноизлечимых форм наследственной слепоты из-за митохондриальной природы мутации. В отличие от ядерных заболеваний, мутация находится в митохондриальной ДНК, редактировать которую сложно. Заболевание проявляется в возрасте от 15 до 35 лет, сначала страдает один глаз, а затем через несколько недель или месяцев — второй.
Основная причина — мутация mt.11778G>A в гене MT-ND4, который кодирует субъединицу 4 NADH-дегидрогеназы (ND4), участвующей в комплексе I дыхательной цепи. Эта мутация заменяет аргинин на гистидин в позиции 340 (R340H), что нарушает поток электронов в комплексе I, снижая эффективность окислительного фосфорилирования. Снижается синтез АТФ, возникает избыток активных форм кислорода, нарушается кальциевый гомеостаз. Ганглиозные клетки сетчатки, имея высокую энергетическую потребность и длинные аксоны, погибают, что приводит к атрофии зрительного нерва и необратимой потере центрального зрения.
— Почему митохондриальную ДНК так сложно редактировать напрямую? Что заставило ученых искать обходной путь — аллотопическую экспрессию? В чем заключается предложенный вами подход? Как удалось перенести рабочую копию гена ND4 из митохондрий в ядро клетки и затем вернуть белок обратно по назначению?
— Прямое редактирование митохондриальной ДНК затруднено двойной мембраной органеллы, и доставить туда инструменты редактирования сложнее, чем в ядро. В одной клетке могут находиться сотни митохондрий, и в каждой — несколько копий ДНК. Чтобы исправить фенотип, необходимо отредактировать практически все мутантные копии, что технически невозможно. Эти препятствия и вынуждают создать рабочую копию целевого гена вне митохондрий. Аллотопическая экспрессия относится к экспрессии генов в ядре клетки, которые обычно экспрессируются только из митохондриального генома.
Мы создали генетическую конструкцию, оптимизированную для синтеза белковой субъединицы ND4 (назвали ее ND4opt) вне митохондрии. К началу гена ND4opt мы присоединили последовательность, кодирующую митохондриальный сигнал транслокации (MTS). Это короткий пептид, который направляет белки из цитоплазмы в митохондрии. Мы протестировали пять различных MTS и нашли самый эффективный — MTS-cox8k. В итоге функционально активный белок ND4 оказывается во внутренней мембране митохондрий, где и должен работать в составе комплекса I дыхательной цепи.
— Вы протестировали пять различных митохондриальных сигнальных последовательностей (MTS). Почему выбор «транспортного адреса» оказался критически важен? И почему не существует универсального решения для всех белков?
— Выбор MTS обусловлен тем, что недостаточно доставить ген в ядро и даже синтезировать белок, нужно, чтобы белок оказался именно в том компартменте митохондрий, где он работает, и в нужной конформации. Мы тестировали пять различных MTS, присоединенных к ND4. Результаты оказались различными. Выяснилось, что некоторые MTS могут быть не только бесполезны, но и вредны. Взаимодействие MTS со структурой самого транспортируемого белка имеет значение. MTS находится на N-конце, но дальнейшее свойство белка зависит от того, как этот N-концевой хвост взаимодействует с последующими частями. Подходящий MTS для одного белка может не подойти для другого из-за различных локальных зарядов и гидрофобности.
— Какая последовательность показала наилучший результат (MTS-cox8k) и какие цифры подтверждают ее эффективность? Что означают показатели снижения активных форм кислорода на 72%, уменьшения кальция на 47% и роста мембранного потенциала на 38%?
— Наилучший результат показала последовательность MTS цитохромоксидазы 8 (MTS-cox8k). Этот MTS, присоединенный к N-концу белка ND4, обеспечил наибольшую коррекцию митохондриальной функции в нашей модели HEK-293 (LHON) с уменьшением уровней активных форм кислорода на 72%, митохондриального кальция на 47% и ростом мембранного потенциала митохондрий на 38%.
При дефектах комплекса I ЭТЦ электроны переходят на кислород и образуют активные формы кислорода (АФК), которые повреждают липиды, белки и ДНК. Снижение АФК указывает на то, что доставленный белок ND4 восстановил нормальный поток электронов и остановил утечку.
В норме митохондрии поглощают Ca как буфер, но при повреждении комплекса I мембранный потенциал падает, и кальций накапливается до токсичных уровней. Снижение уровня митохондриального кальция — признак того, что опасная перегрузка ушла, а кальциевые транспортеры работают правильно.
Мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) создается комплексом I, III и IV за счет выкачивания протонов в межмембранное пространство. Это напряжение движет синтез АТФ. Рост ΔΨm означает, что комплекс I с нашей рабочей копией ND4 снова может переносить протоны, и клетка получает больше энергии.
— Какую клеточную модель вы создали для тестирования? Почему для первичных экспериментов подошла линия HEK-293 с митохондриями пациентов и какие у этой модели есть ограничения?
— Мы создали линию HEK-293-LHON, несущую мутацию mt.11778G>A в гене MT-ND4. Для этого мы сначала лишили исходные HEK-293 их собственных митохондрий, длительно культивируя клетки с бромистым этидием (EtBr), уридином и пируватом, так получили линию HEK-293 Rho0 (клетки без митохондрий). Затем ввели в них митохондрии от пациента с болезнью Лебера (из фибробластов) путем совместного культивирования.
Модель воспроизводит признаки LHON по сравнению с нормальными HEK-293. Уровень АФК и митохондриального Ca2+ повышен, а мембранный потенциал снижен. Это не нейроны и не ганглиозные клетки сетчатки, которые погибают при нейропатии Лебера. Однако эти клетки имеют частично нейрональный паттерн экспрессии, что обеспечивает релевантную физиологию и подходит для биотехнологических исследований.
Наша модель станет первым элементом промышленной тест-системы. На ее основе можно организовать контроль качества серий будущего продукта — тестирование активности каждой серии AAV-вектора в строго воспроизводимых условиях.
— Что будет дальше? Какие следующие этапы запланированы: нейрональные модели, испытания на ганглиозных клетках сетчатки, доклинические исследования на животных?
— Мы продемонстрировали эффективность в нашей модели, но необходимо доказать, что это приводит к спасению ганглиозных клеток сетчатки и сохранению зрения in vivo. Если результаты на нейрональных моделях и животных подтвердятся, можно будет говорить о следующем поколении терапии LHON с улучшенной эффективностью.
Наша работа — это оптимизация уже существующего подхода, а не его создание с нуля. Поэтому переход к доклиническим и клиническим испытаниям может быть быстрее, чем для новой технологии.
— Почему вы считаете, что путь к практическому применению может быть ускорен, несмотря на то, что технология пока находится на доклинической стадии?
— Мы не начинаем с нуля. Мы ориентируемся на технологии, которые уже подтвердили безопасность и потенциальную эффективность аллотопической терапии LHON. Наша задача — не изобретать заново AAV-терапию, а произвести ND4opt с лучшим MTS, что мы уже сделали в клеточной модели. Благодаря промышленно пригодной клеточной линии, четкому продуктовому курсу и возможности использовать существующие клинические данные, мы можем ускорить путь в клинику.
— Чем существующие методы лечения не устраивают врачей и пациентов? Почему они лишь замедляют прогрессирование, но редко восстанавливают зрение?
— На сегодняшний день для лечения применяется идебенон — синтетический аналог коэнзима Q10. Он выступает как искусственный переносчик электронов, частично обходя дефектный комплекс I. Но дефектный белок ND4 остается, и окислительный стресс продолжается.
Клинические исследования показывают, что идебенон дает шанс на улучшение (особенно при раннем начале), но у большинства пациентов зрение не восстанавливается, а продолжает падать до уровня слепоты. Он имеет узкое терапевтическое окно, и если пациент обратился поздно, шансы минимальны.
— Если ваша технология дойдет до клиники, чего смогут ждать пациенты? Можно ли говорить о восстановлении утраченного зрения или речь идет только о предотвращении дальнейшей потери?
— Эффект зависит от стадии заболевания, на которой пациент получит терапию. Есть разница между ранней фазой — первые месяцы после начала падения зрения, когда ганглиозные клетки сетчатки (ГКС) еще живы, и поздней фазой, когда значительная часть ГКС уже погибла, и зрительный нерв атрофирован. Если пациент на ранней стадии, можно ожидать остановку прогрессирования и частичное восстановление зрения. Если же пациент на поздней стадии, когда прошло несколько лет от начала болезни и глазное дно показывает атрофию диска зрительного нерва, вернуть зрение уже невозможно. Поэтому ранняя диагностика при LHON — важная часть терапии.
Фото: hi-tech.mail.ru
Материалы проходят проверку с учетом современных клинических рекомендаций, научных данных и практического опыта врачей. Основная задача Медколлегии — обеспечить достоверность, актуальность и понятность медицинской информации для пользователей.